Xem 23,661
Cập nhật thông tin chi tiết về Đồ Án So Sánh Hai Phương Pháp Định Lượng Berberin Nguyên Liệu Bằng Hplc Theo Dược Điển Trung Quốc (2005) Và Bằng Đo Quang Phổ Hấp Thụ Uv mới nhất ngày 02/07/2022 trên website Sansangdethanhcong.com. Hy vọng nội dung bài viết sẽ đáp ứng được nhu cầu của bạn, chúng tôi sẽ thường xuyên cập nhật mới nội dung để bạn nhận được thông tin nhanh chóng và chính xác nhất. Cho đến thời điểm hiện tại, bài viết này đã đạt được 23,661 lượt xem.
--- Bài mới hơn ---
Nhưvậy, nếu không yêu cầu độchính xác cao, có thểdùng phương
pháp đo quang phổhấp thụUV-VIS theo DĐVN III để định lượng berberin
nguyên liệu (đạt yêu cầu về giới hạn tạp chất palmatin không quá 2%) vì
phương pháp này không tốn kém, tiến hành nhanh, thao tác đơn giản, dễthực
hiện. Với thành phẩm do không quy định hàm lượng palmatin và những tạp
khác cũng có thểhấp thụUV nên đểcó kết quả định lượng chính xác thì nên
dùng phương pháp HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005).
* Tiến hành:
9
Lần lượt tiêm các dung dịch thử và chuẩn. Dựa vào đáp ứng của pic
berberin trong dung dịch thử, chuẩn và hàm lượng dung dịch chuẩn, tính
lượng berberin cĩ trong chế phẩm.
Phương pháp 3:
1.3.2. Cơ sở lý thuyết
Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và
phân bố của các chất tan giữa 2 pha khác nhau. Khi pha động di chuyển với
10
một tốc độ nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ ra
khỏi cột. Tùy theo bản chất pha tĩnh, chất tan và dung mơi mà quá trình rửa
giải tách được các chất khi ra khỏi cột sắc ký. Nếu ghi quá trình tách sắc ký,
chúng ta cĩ sắc đồ.
1.3.3. Các thơng số đặc trưng của quá trình sắc ký:
Kết quả của quá trình sắc kí được detector phát hiện, phĩng đại và ghi
thành sắc ký đồ( hình 1):
Hình 1: sắc ký đồ của 2 chất và các thơng số đặc trưng
Trong đĩ :
to (thời gian chết): Là thời gian cần thiết để pha động chảy qua cột tách
tR (thời gian lưu): thời gian kể từ khi chất cần phân tích được bơm vào
cột cho đến khi xuất hiện đỉnh của pic chất cần phân tích.
tR’ (thời gian lưu thực ) = tR- to.
W0,5: Độ rộng pic ở nửa chiều cao
Wb: Độ rộng đáy pic.
1.3.2.1. Hệ số dung lượng k’
, , .
1.3.2.5. Số đĩa lý thuyết N
Đặc trưng cho hiệu lực cột.
12
N = 16
w
t
B
R
2
hay N=5,54
w
t
B2/1
R
2
Nếu gọi L là chiều cao cột sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý thuyết H
được tính bằng cơng thức: =H
N
L
1.3.4. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC
Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao
gồm 6 bộ phận chính sau:
a/Hệ thống bơm
Để bơm pha động vào cột tách. Bơm này phải điều chỉnh được áp suất
(0 – 400 bar)
a/ Bình chứa dung mơi và hệ thống xử lý dung mơi
Bình chứa dung mơi thường bằng thủy tinh hoặc thép khơng gỉ. Dung
mơi chạy sắc ký được lọc qua màng lọc (thường màng lọc cỡ lỗ 0,45 µm ) và
đuổi khí hịa tan.
c/ Hệ tiêm mẫu
Để đưa mẫu phân tích vào cột.
Cĩ nhiều phương pháp tiêm mẫu khác nhau, đơn giản nhất là sử dụng
một van tiêm. Trong các hệ thống sắc ký hiện đại là hệ tiêm mẫu tự động.
Trong sắc ký lỏng, mẫu lỏng cĩ thể được tiêm ngay sau khi lọc loại tạp
qua màng lọc 0,45 µm, cịn mẫu rắn cần hịa tan trong 1 dung mơi
thích hợp.
d/ Cột sắc ký lỏng HPLC
Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hĩa chất, chịu được với áp
suất cao đến vài trăm bar.
– Chiều dài cột: 10, 15, hoặc 25 cm; thích hợp với các tiểu phân pha
tĩnh cĩ đường kính rất nhỏ (3, 5, 10 µm).
– Đường kính cột: 4 hoặc 4,6 mm.
13
e/ Detector trong HPLC
Là bộ phận phát hiện chất phân tích, tùy theo bản chất của chất cần
phân tích mà sử dụng detector thích hợp. Detector hay sử dụng là detector hấp
thụ UV – VIS. Ngồi ra cịn cĩ detector khúc xạ, huỳnh quang, điện hĩa.
f/ Thiết bị hiển thị kết quả
Cĩ nhiều loại nhưng đơn giản và phổ biến nhất là máy tự ghi để tín
hiệu đo dưới dạng pic.
Sơ đồ khối hệ thống HPLC được tổng quát ở hình 2
Hình 2: Sơ đồ khối tổng quát hệ thống HPLC
1.3.5. Cách đánh giá pic,,,
1.4.2.1. Phương pháp đo phổ trực tiếp:
Đo độ hấp thụ của dung dịch, tính nồng độ C của dung dịch dựa vào giá
trị 11%
cmE biết trước (tra cứu).
A = 11%
cmE .C.l → C = 1
1%
cm
A
E
(với l =1 cm)
17
Trong phương pháp này, phải chú ý kiểm tra máy đo về bước sĩng (ở) và
mật độ quang A bằng cách:
Dùng đèn thuỷ ngân, đèn D2 (cho một vạch sáng cĩ bước sĩng xác
định).
Dùng một mẫu chuẩn, đo và điều chỉnh để tìm sai số.
Dùng một kính lọc Holmium (cĩ các giá trị ởmax xác định cho trong
tài liệu )để kiểm tra lại máy.
Dùng dung dịch K2CrO4, K2Cr2O7 tinh khiết quang phổ pha thành
dung dịch cĩ nồng độ chính xác. Đo phổ tìm các giá trị ởmax và tìm
Amax .
1.4.2.2. Phương
pháp so sánh
Đo độ hấp thụ Ax, Ac của dung dịch thử cĩ nồng độ Cx (chưa biết) và của
dung dịch chuẩn cĩ nồng độ Ac (đã biết).
Ta cĩ: x
c
A
A
=
xC
cC
→ Cx = x
c
A
A
x Cc
Chú ý: nồng độ của dung dịch thử Cx và của dung dịch chuẩn Cc khơng
được chênh lệch nhau quá nhiều. Nồng độ dung dịch này càng gần nhau, kết
quả càng chính xác.
Ngồi ra cịn cĩ các kỹ thuật định lượng khác như: phương pháp đường
chuẩn, phương pháp thêm đường chuẩn, phương pháp chuẩn độ đo quang,
phương pháp định lượng hỗn hợp theo nguyên tắc cộng phổ .
18
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Nguyên liệu, hố chất, thuốc thử:
2.1.1.1. Đối tượng nghiên cứu:
. Berberin clorid: Chất chuẩn hàm lượng 83,3% do Viện kiểm nghiệm
thuốc TW cung cấp
. Berberin clorid dạng nguyên liệu do bộ mơn Hố Dược cung cấp
. Palmatin: do viện kiểm nghiệm thuốc TW cung cấp
2.1.1.2. Hố chất, thuốc thử:
. Muối potasium dihydrophosphate (KH2PO4), acid phosphoric
(H3PO4)
. Heptane sodium sulfonate, triethylamine
. Acetonitril dùng cho HPLC (Merk)
. Nước cất 2 lần (cất trực tiếp tại Bộ mơn Hĩa vơ cơ trường đại học
Dược Hà Nội) dùng cho máy HPLC
. Một vài hĩa chất khác
2.1.1.3. Thiết bị:
+ Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao: DIONEX- Detector UV Diode
array- PDA 100
+ Cân phân tích AY 220 , Max = 220 g, độ chính xác 0,1 mg
+ Máy đo pH JENWAY của Anh
+ Máy cất nước 2 lần
+ Máy lắc siêu âm EBRO ARMATUREN của Đức
19
+ Máy lọc hút chân khơng Satorius
+ Bình định mức các loại: 20,0 ml; 25,0 ml; 100,0 ml …
+ Cốc cĩ mỏ: các loại 100; 200; 500
+ Pipet chính xác, pipet thường, đũa thủy tinh.
+ Bơm tiêm, lọ đựng mẫu, màng lọc 0,45 µm…
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu:
2.1.2.1. Chỉ tiêu nghiên cứu:
. Phân tích mẫu thử bằng phương pháp HPLC và phương pháp đo
quang phổ hấp thụ UV- VIS
. Đánh giá độ chính xác, tính đúng, tính tuyến tính, tính đặc hiệu của
hai phương pháp trên
. So sánh 2 phương pháp trên
2.1.2.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu:
Nghiên cứu trên lý thuyết và tài liệu tham khảo để lựa chọn
phương pháp phân tích
Bằng thực nghiệm, dựa vào kết quả thu được, xử lý thống kê và
rút ra kết luận
Phương pháp sử dụng trong thực nghiệm: HPLC, Đo quang phổ
hấp thụ UV-VIS
2.1.2.3.Phương pháp xử lý số liệu thống kê:
. Dữ liệu thu được được xử lý bằng phương pháp thống kê – sử dụng
cơng cụ hỗ trợ là phần mềm Microsoft Excel
. Một số đặc trưng thống kê được sử dụng:
– Giá trị trung bình: ∑
=
=
n
1i
ixn
1
x
– Độ lệch chuẩn:
( )
1n
x
S
n
1i
2
ix
−
−
=
∑
=
20
– Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): RSD% = S
x
× 100
– Sai số chuẩn :
n
S
sx =
– Sai số tương đối: ( ) 100
x
% st x)1n( ××=ε −α
– Khoảng tin cậy: µ = x ± tαSx
Trong đĩ : xi là kết quả xác định lần thứ i ; n là số lần xác định
+ Tiêu chuẩn Fischer để đánh giá độ chính xác hay độ lặp lại của 2
phương pháp thí nghiệm khác nhau : Ftn =
2
1
2
2
S
S
nghĩa thống kê
nhau cĩ ý nghĩa thống kê
Ftn<Flt : độ chính xác hay độ lặp lại của hai phương pháp khác
nhau khơng cĩ ý nghĩa thống kê
Flt tra bảng ở mức tin cậy 95% khi bậc tự do K = n – 1
+ Test T để so sánh giá trị trung bình kết quả định lượng của hai
phương pháp khác nhau :
T =
1 2
1 2
1 1p
n n
X X
S +
−
( ) ( )2 21 1 2 2
1 2
1 1
2
n S n S
n n
− + −
+ −
21
T < 1 2 2/2n ntα
+ −
: giá trị trung bình kết quả định lượng của hai
phương pháp khác nhau khơng cĩ ý nghĩa thống kê
+ −
: giá trị trung bình kết quả định lượng của hai
phương pháp khác nhau cĩ ý nghĩa thống kê
1 2 2/2
n ntα
+ −
tra bảng ở mức tin cậy 95% khi bậc tự do K = n1+n2-2
2.2. Kết quả thực nghiệm :
2.2.1. Định lượng Berberin clorid nguyên liệu bằng phương pháp đo
quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III *
Cách tiến hành :
+ Dung dịch thử : Cân 0,200 g chế phẩm và hồ tan trong 200 ml
nước bằng cách đun nĩng. Sau đĩ làm lạnh và thêm nước đến 1000 ml. Lấy
10 ml dung dịch này pha lỗng với nước đến 100 ml (C = 20 µ g/ml)
+ Dung dịch chuẩn được pha tương tự dung dịch thử , dùng chất đối
chiếu berberin clorid
+ Đo độ hấp thụ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn trong cùng
điều kiện tại bước sĩng cực đại 421 nm với mẫu trắng là nước cất, cốc đo dày
1 cm.
* Cách tính kết quả :
*
Do cĩ sẵn berberin, mặt khác dự định áp dụng phương pháp này cho cả berberin trong các dạng bào chế nên
chúng tơi thay kali dicromat bằng berberin chuẩn.
22
Theo phương pháp so sánh, hàm lượng phần trăm được tính theo cơng
thức : C% = t c
c t
mA
mA
×
×
× C
Trong đĩ :
C% : Hàm lượng % Berberin clorid cĩ trong mẫu thử.
C : Hàm lượng % Berberin clorid cĩ trong mẫu chuẩn
At : Độ hấp thụ của dung dịch thử.
Ac : Độ hấp thụ của dung dịch chuẩn.
mt : Khối lượng tính bằng gam của Berberin clorid trong bột
nguyên liệu đã cân để pha dung dịch thử.
mc : Khối lượng tính bằng gam của Berberin clorid chuẩn đã
cân để pha dung dịch chuẩn.
Tiến hành định lượng 5 mẫu. Kết quả ghi trong bảng 1 .
Bảng1 : Kết quả định lượng Beberin clorid trong nguyên liệu
STT Khối lượng cân(g) Độ hấp thụ(A) C%
1 0,1971 0,269 86,50
2 0,2010 0,272 85,76
3 0,2062 0,280 86,06
4 0,2090 0,285 86,42
5 0,2030 0,277 86,48
Chuẩn 0,2001 0,263 83,30
23
Theo kết quả ở bảng 1, ta cĩ:
Giá trị trung bình: X = 86,24%
Độ lệch chuẩn : S = 0,324
Khoảng tin cậy của giá trị trung bình (ở mức tin cậy 95%):
∆X(%) = 0,40
Độ lệch chuẩn tương đối: RSD = 0,37%
Kết luận: Hàm lượng Beberin clorid trong bột nguyên liệu là 86,24%
± 0,40%.
2.2.2. Đánh giá phương pháp định lượng Berberin clorid nguyên liệu
bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III
2.2.2.1./Tính chính xác :
Nguyên tắc: Độ chính xác của phương pháp được đánh giá bằng độ
lệch chuẩn tương đối của các phép thử song song.
Cách tiến hành và kết quả được trình bày như trong phần 2.2.1.1
Kết quả thử độ chính xác của phương pháp cho thấy độ lệch chuẩn
tương đối của các kết quả (RSD = 0,37% < 2%). Như vậy phương pháp là
chính xác
2.2.2.2 Tính tuyến tính:
Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp
thụ trên chất chuẩn Berberin.
Cân 5 mẫu chất chuẩn Berberin clorid cĩ khối lượng từ 0,1600g→
0,2400g ( tại các điểm 80%,90%,100%,110%,120% nồng độ dùng khi định
lượng)
Cách tiến hành tương tự 2.2.1
Bảng 2: Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ dung dịch
24
STT 1 2 3 4 5
C
(mg/ml)
0,0161 0,0180 0,0202 0,0220 0,0240
A 0,215 0,239 0,262 0,286 0,315
Hình 6 .Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào
nồng độ dung dịch
– Phương trình hồi quy biểu thị mối tương quan giữa mật độ quang và
nồng độ dung dịch là: y = 12,5 x + 0,013;
– Hệ số tương quan: 0,998
– Độ lệch chuẩn của y_ intercept: Sb = 0,009
– Với độ tin cậy 95% ta cĩ khoảng tin cậy của y_intercept:
b ±3,182Sb = 0,013 ± 0,029 hay – 0,016 ≤ y_intercept ≤ 0,042
Từ kết quả trên cho thấy hệ số tương quan của đường hồi quy vượt
quá 0,99…Tất cả các giá trị nằm trên đường hồi quy hoặc phân bố đồng đều
cả hai phía của đường hồi quy.
Khoảng tin cậy của y_intercept chứa 0.
Vậy phương pháp là tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 80% đến
120% nồng độ làm việc.
y = 12.5x + 0.013
R = 0.998
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03
§
é
h
Êp
t
h
ơ
A
C(mg/ml)
25
2.2.2.3. Độ đúng:
. Cân 3 mẫu chất đối chiếu Beberin clorid ( hàm lượng 83,3%) với
khối lượng từ 0,1600g → 0,2400g (tại các điểm 80, 100, 120% so với lượng
cân dùng khi định lượng)
. Tiến hành tương tự 2.2.1. Mỗi mẫu đo 3 lần, lấy kết quả trung bình
. Tính tốn kết quả khảo sát độ đúng dựa vào độ hấp thụ của mẫu
chuẩn là 0,263 ứng với khối lượng cân 0,2001g
Kết quả thu được ghi ở bảng 3
Bảng 3: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đo quang phổ
hấp thụ UV-VIS
STT Khối
lượng cân
(g)
Lượng hoạt
chất cĩ thực
a (g)
Độ hấp
thụ trung
bình (A)
Lượng tìm
lại trung
bình b (g)
Phần trăm
tìm lại
(b/a.100%)
1 0,1605 0,1337 0,208 0,1322 98,88
2 0,2020 0,1683 0,267 0,1696 100,77
3 0,2362 0,1967 0,313 0,1984 100,86
Từ kết quả bảng 3 ta cĩ:
– Trung bình % tìm lại: 100,17%
– Phương trình hồi quy về mối tương quan giữa lượng hoạt chất ban
đầu và lượng hoạt chất tìm lại là: y = 1,052x – 0,008
– Hệ số tương quan: r = 0,999
26
– Độ lệch chuẩn của y_intercept: Sb = 0,003
– Độ lệch chuẩn của độ dốc: Sa = 0,019
– Với độ tin cậy 95% ta cĩ:
Khoảng tin cậy của độ dốc: a ± 3,182Sa = 1,052 ± 0,060 hay 0,992
< a < 1,112
Khoảng tin cậy của y_intercept: b ± 3,182Sb = – 0,008 ± 0,009
hay – 0,017 < y_intercept < 0,001
Hình 7: Đồ thị biểu diễn phương trình hồi quy tuyến tính về mối
tương quan giữa lượng hoạt chất tìm lại và lượng hoạt chất cĩ thực
Kết luận:
– Khơng cĩ sai số hệ thống hằng định vì khoảng tin cậy của
y_intercept chứa 0.
– Khơng cĩ sai số hệ thống tỷ lệ vì khoảng tin cậy độ dốc chứa 1.
– Giá trị trung bình của tỷ lệ thu lại là 100,17% nghĩa là nằm trong
khoảng từ 98% đến 102%.
Như vậy, phương pháp đưa ra là đúng trong khoảng khảo sát.
2.2.2.4. Tính đặc hiệu:
Như trong phần 1.1.2 đã trình bày, các tạp chất cần xác định trong
Berberin nguyên liệu là Palmatin và Jatrorrhizin. Nhưng trong điều kiện thí
nghiệm khơng cĩ chất chuẩn Jatrorrhizin, chúng tơi chỉ tiến hành xác định sự
ảnh hưởng của tạp chất Palmatin đối với phương pháp định lượng
y = 1.052x – 0.008
R = 0.999
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
L
ỵ
n
g
t
×m
l
¹i
(
g
)
Lỵng ho¹t chÊt cã thùc (g)
27
Tiến hành:
+ Cân 0,200 g chất chuẩn berberin clorid và hịa tan trong 200 ml
nước bằng cách đun nĩng. Sau đĩ làm lạnh và thêm nước đến 1000 ml, thu
được dunhg dịch berberin chuẩn 0,2 mg/ml. Lấy 10 ml dung dịch này cho vào
4 bình định mức 100 ml.
+ Pha dung dịch Palmatin 10%, 5% và 2,5% so với nồng độ của
berberin clorid đem đo
. Cân 0,02 g Palmatin chuẩn và hịa tan trong 20 ml nước bằng cách
đun nĩng. Sau đĩ làm lạnh và thêm nước đến 100 ml. Lấy 10 ml dung dịch
này cho vào bình định mức 100 ml và thêm nước vừa đủ tới vạch, được dung
dịch palmatin chuẩn 0,02 mg/ml
. Lấy 25 ml dung dịch palmatin 0,02 mg/ml cho vào bình định mức 50
ml và thêm nước vừa đủ tới vạch, ta được dung dịch palmatin 0,01 mg/ml.
. Lấy 25 ml dung dịch palmatin 0,01 mg/ml cho vào bình định mức
50 ml và thêm nước vừa đủ tới vạch, được dugn dịch palmatin 0,005 mg/ml.
. Lần lượt thêm 10 ml dung dịch palmatin 0,02; 0,01; 0,005 mg/ml
vào 3 bình định mức 100 ml đã chứa berberin clorid chuẩn trên và thêm nước
vừa đủ tới vạch. Một bình định mức 100 ml khơng thêm palmatin và thêm
nước tới vạch. Đem đo độ hấp thụ quang của dung dịch 4 bình này tại bước
sĩng 421 nm
Bảng 4: Kết quả thu được về sự ảnh hưởng của tạp chất palmatin tới
độ hấp thụ quang của berberin clorid
Bình 1 Bình 2 Bình 3 Bình 4
Berberin clorid 0,2 mg/ml
(ml)
10 10 10 10
Palmatin 0,02 mg/ml (ml) 10
Palmatin 0,01 mg/ml (ml) 10
28
Palmatin 0,005 mg/ml (ml) 10
Độ hấp thụ A 0,263 0,282 0,271 0.266
Nhận xét: Từ kết quả bảng trên, ta thấy độ hấp thụ quang của dung
dịch tăng theo sự tăng của nồng độ dung dịch palmatin. Khi thêm 2,5%
palmatin, hàm lượng berberin trong bột nguyên liệu định lượng theo phương
pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS của DĐVN III tăng 1,14%. Nếu cĩ 2%
palmatin như trong giới hạn về palmatin mà DĐVN III yêu cầu thì kết quả
định lượng tăng 0,91%
Vậy phương pháp khơng cĩ tính đặc hiệu.
2.2.3. Định lượng berberin clorid nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển
Trung Quốc (2005):
Điều kiện sắc ký để định lượng Berberin clorid nguyên liệu
– Cột sắc ký: hạt nhồi silicagel được octadecylsilan hĩa
– Detector UV: 263 nm
– Pha động: đệm phosphate BERBERIN T H10,4 UV_VIS_1
mAU
min
1 – 4.653
2 – 7.420
WVL:263 nmAz
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.1
-0.10
1.0 ] UV_VIS_1
mAU
min
WVL:263 nm
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.1
-5.0
35.0 BERBERIN CH UV_VIS_1
mAU
min
1 – 7.353
WVL:263 nm
36
Các tính tốn được thực hiện trên các kết quả thu được khi định lượng
Berberin clorid nguyên liệu do bộ mơn Hĩa Dược trường Đại Học Dược Hà
Nội cung cấp.
Tĩm tắt kết quả thu được khi định lượng nguyên liệu Berberin clorid
bằng hai phương pháp ở bảng 9
Bảng 9: Tĩm tắt các kết quả thực nghiệm thu được khi định lượng
nguyên liệu Berberin clorid
Phương
pháp
Hàm lượng
trung bình
(%)
Phương sai
(S2)
Độ lêch
chuẩn (S)
Số lần thí
nghiệm
HPLC 86,09 0,0645 0,254 5
Đo quang
UV-VIS
86,24 0,1050 0,324 5
Ftn = 0,1050/0,0645 = 1,3
S1: độ lệch chuẩn của phương pháp đo quang UV-VIS
S2: độ lệch chuẩn của phương pháp HPLC
Flt ( ở mức tin cậy 95% khi bậc tự do K1 = 5 – 1 = 4; K2 = 5 – 1 = 4) là:
6,39
Như vậy Ftn<Flt do đĩ độ lặp lại của 2 phương pháp định lượng
Berberin nguyên liệu khác nhau khơng cĩ ý nghĩa thống kê.
2.2.3.2. So sánh kết quả giá trị trung bình của hai phương pháp định
lượng
:
Do độ lặp lại của 2 phương pháp định lượng khác nhau khơng cĩ ý
nghĩa thống kê nên để so sánh kết quả giá trị trung bình của hai phương pháp
định lượng, ta dùng Test T.
37
T =
1 2
1 2
1 1p
n n
X X
S +
−
với
pS =
( ) ( )2 21 1 2 2
1 2
1 1
2
n S n S
n n
− + −
+ −
T phân phối Student với n1 + n2 – 2 bậc tự do
ở mức tin cậy 95% hay ỏ =0,05, ta cĩ: ( )1 2 2 8/2 0,025n nt tα
+ −
= =2,306
pS =
4.0,0645 4.0,1050
5 5 2
+
+ −
= 0,291
Do đĩ Tqs =
86,24 86,09
1 10,291
5 5
−
+
= 0,815
Như vậy 0,815 < 2,306 nên với mức ý nghĩa 0,05 giá trị trung bình
hàm lượng Berberin trong nguyên liệu của hai phương pháp định lượng khác
nhau khơng cĩ ý nghĩa thống kê.
2.2.3.2. Đánh giá ưu nhược điểm của hai phương pháp định lượng
Berberin clorid trong bột nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung
Quốc (2005) và bằng đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III
Phương pháp HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005):
+ Ưu điểm:
. Phương pháp cĩ tính đặc hiệu khi cĩ mặt tạp chất palmatin
+ Nhược điểm:
. Yêu cầu phải cĩ các hĩa chất dung mơi tinh khiết dùng cho HPLC
. Chi phí cao khi phải chạy pha động cĩ acetonitril và đặc biệt là hĩa
chất heptan natri sulfonat rất đắt tiền
. Quá trình chuẩn bị chạy sắc ký và chạy đường nền tốn thời gian
Phương pháp đo quang phổ UV-VIS theo DĐVN III:
+ Ưu điểm:
. Khơng tốn hĩa chất dung mơi
38
. Thời gian phân tích nhanh chĩng, chỉ cần 5-10 phút cĩ thể cho biết
ngay kết quả
. Kỹ thuật thao tác đơn giản, máy mĩc dễ tìm, gọn nhẹ
+ Nhược điểm:
Phương pháp khơng cĩ tính đặc hiệu (palmatin ảnh hưởng tới kết quả
định lượng)
2.3. BÀN LUẬN:
Phương pháp HPLC là một phương pháp phân tích hiện đại, đang
từng bước được đưa vào phịng kiểm nghiệm và trung tâm kiểm nghiệm ở
Việt Nam. Phương pháp định lượng Berberin nguyên liệu bằng HPLC theo
dược điển Trung Quốc (2005) cho biết hàm lượng Berberin trong nguyên liệu
là 86,09% ± 0,315%; phương pháp chính xác với RSD = 0,295% < 2%, tuyến
tính trong khoảng 80%-120% nồng độ định lượng và đúng trong khoảng khảo
sát. Ưu điểm của phương pháp này là cĩ tính đặc hiệu khi cĩ mặt tạp chất
palmatin trong nguyên liệu Berberin. Tuy nhiên phương pháp này lại rất tốn
kém khi phải dùng những dung mơi và hĩa chất đắt tiền như: natri heptan
sulfonat, acetonitril…
Hàm lượng Berberin trong nguyên liệu khi định lượng bằng phương
pháp đo quang phổ UV-VIS theo DĐVN III là 86,24% ± 0,40%; phương
pháp chính xác với RSD = 0,37% < 2%, tuyến tính trong khoảng 80%-120%
nồng độ định lượng và đúng trong khoảng khảo sát nhưng khơng đặc hiệu (
tạp chất palmatin ảnh hưởng tới kết quả định lượng). Tuy nhiên. DĐVN III cĩ
quy định giới hạn tạp chất palmatin khơng quá 2% ………………………………………………………………… 5
1.1.7. Dạng thuốc và hàm lượng: , ……………………………………………………………….. 6
1.2.4. Phương pháp HPLC ………………………………………………………………… 7
1.3. TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP HPLC ……………………………………….. 9
1.3.1. Nguyên tắc ………………………………………………………………………………. 9
1.3.2. Cơ sở lý thuyết ………………………………………………………………………… 9
1.3.3. Các thơng số đặc trưng của quá trình sắc ký: …………………………… 10
Hình 1: sắc ký đồ của 2 chất và các thơng số đặc trưng ………………………. 10
1.3.2.1. Hệ số dung lượng k’ ………………………………………………………………. 10
1.3.2.2 Độ chọn lọc α (selectivity – factor) …………………………………………… 11
α khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng, tối ưu từ 1,5 đến 2. …… 11
1.3.2.3. Độ phân giải (resolution) ………………………………………………………. 11
=R
( ) ( )
α
−α
=
+
−
=
+
−
+ ‘k1
‘k
ww
tt
ww
tt
B
B
A2/1B2/1
A,RB,R
AB
A,RB,R 1
4
N18,12
…………………. 11
Độ phân giải cơ bản đạt được khi R = 1,5 ……………………………………………. 11
1.3.2.4. Hệ số bất đối AF …………………………………………………………………… 11
Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, nĩ được tính theo cơng thức: ……… 11
Trong đĩ:………………………………………………………………………………………… 11
1.3.2.5. Số đĩa lý thuyết N ………………………………………………………………….. 11
N = 16
w
t
B
R
2
hay N=5,54
w
t
B2/1
R
2
……………………………… 12
1.3.4. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC ………………………………. 12
a/Hệ thống bơm ………………………………………………………………………………. 12
a/ Bình chứa dung mơi và hệ thống xử lý dung mơi …………………………….. 12
c/ Hệ tiêm mẫu ……………………………………………………………………………….. 12
44
d/ Cột sắc ký lỏng HPLC ………………………………………………………………….. 12
e/ Detector trong HPLC ……………………………………………………………………. 13
Hình 2: Sơ đồ khối tổng quát hệ thống HPLC ……………………………………. 13
1.3.5. Cách đánh giá pic,,, …………………………………………………………………………………. 16
1.4.2.1. Phương pháp đo phổ trực tiếp: ………………………………………………. 16
1.4.2.2. Phương
pháp so sánh …………………………………………………………… 17
PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ………………………………………. 18
2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu ……………………………… 18
2.1.1. Nguyên liệu, hố chất, thuốc thử: ……………………………………………. 18
2.1.1.1. Đối tượng nghiên cứu: …………………………………………………………. 18
2.1.1.2. Hố chất, thuốc thử: ……………………………………………………………. 18
2.1.1.3. Thiết bị: ……………………………………………………………………………… 18
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu: ………………………………………………………. 19
2.1.2.1. Chỉ tiêu nghiên cứu: ……………………………………………………………. 19
2.1.2.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu: ……………………… 19
2.1.2.3.Phương pháp xử lý số liệu thống kê: ……………………………………… 19
2.2. Kết quả thực nghiệm : ………………………………………………………………. 21
2.2.1. Định lượng Berberin clorid nguyên liệu bằng phương pháp đo
quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III ……………………………………. 21
Bảng1 : Kết quả định lượng Beberin clorid trong nguyên liệu……………. 22
2.2.2. Đánh giá phương pháp định lượng Berberin clorid nguyên liệu
bằng phương pháp đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III ……. 23
2.2.2.1./Tính chính xác : ………………………………………………………………….. 23
Nguyên tắc: Độ chính xác của phương pháp được đánh giá bằng độ lệch
chuẩn tương đối của các phép thử song song. ……………………………………….. 23
2.2.2.2 Tính tuyến tính: ……………………………………………………………………. 23
Bảng 2: Sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ dung dịch ………… 23
Hình 6 .Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào ………………. 24
2.2.2.3. Độ đúng: …………………………………………………………………………….. 25
2.2.2.4. Tính đặc hiệu:……………………………………………………………………… 26
Bảng 4: Kết quả thu được về sự ảnh hưởng của tạp chất palmatin tới … 27
45
2.2.3. Định lượng berberin clorid nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển
Trung Quốc (2005): ………………………………………………………………………… 28
HL% = 83,30t c
c t
S m
S m
× ×
×
………………………………………………………………………. 29
Bảng 5: Kết quả định lượng Berberin clorid nguyên liệu …………………… 29
2.2.4. Đánh giá phương pháp định lượng berberin clorid nguyên liệu
bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc (2005): ………………………………. 30
2.2.4.1. Tính chính xác: …………………………………………………………………… 30
2.2.4.2. Tính tuyến tính: …………………………………………………………………… 30
Bảng 6: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ dung dịch ………….. 30
2.2.4.3. Tính đúng: ………………………………………………………………………….. 31
Bảng 7: Kết quả khảo sát tính đúng của phương pháp HPLC ……………. 32
2.2.4.4. Tính đặc hiệu:……………………………………………………………………… 33
Hình 12: Sắc ký đồ mẫu trắng ………………………………………………………….. 35
Hình 13: Sắc ký đồ mẫu chuẩn …………………………………………………………. 35
Hình 14: Sắc ký đồ mẫu chuẩn cĩ thêm Palmatin ……………………………….. 35
2.2.5. So sánh hai phương pháp định lượng Berberin clorid trong bột
nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung Quốc 2005 và đo quang
phổ hấp thụ UV-VIS theo dược điển Việt Nam III: …………………………… 35
2.2.5.1. So sánh kết quả độ chính xác của hai phương pháp định lượng: 35
2.2.3.2. So sánh kết quả giá trị trung bình của hai phương pháp định
lượng
: …………………………………………………………………………………………… 36
2.2.3.2. Đánh giá ưu nhược điểm của hai phương pháp định lượng
Berberin clorid trong bột nguyên liệu bằng HPLC theo dược điển Trung
Quốc (2005) và bằng đo quang phổ hấp thụ UV-VIS theo DĐVN III ….. 37
. Khơng tốn hĩa chất dung mơi …………………………………………………………… 37
. Kỹ thuật thao tác đơn giản, máy mĩc dễ tìm, gọn nhẹ ………………………….. 38
2.3. BÀN LUẬN: …………………………………………………………………………….. 38
KẾT LUẬN ……………………………………………………………………………………. 39
* Kết luận ………………………………………………………………………………………. 39
* Đề xuất: ………………………………………………………………………………………. 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ………………………………………………………………. 41
I. Tiếng việt ……………………………………………………………………………………. 41
II. Tiếng Anh …………………………………………………………………………………. 41
III. Trang web ……………………………………………………………………………….. 42
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- _t_v_n__1522.pdf
--- Bài cũ hơn ---
Bạn đang xem bài viết Đồ Án So Sánh Hai Phương Pháp Định Lượng Berberin Nguyên Liệu Bằng Hplc Theo Dược Điển Trung Quốc (2005) Và Bằng Đo Quang Phổ Hấp Thụ Uv trên website Sansangdethanhcong.com. Hy vọng những thông tin mà chúng tôi đã chia sẻ là hữu ích với bạn. Nếu nội dung hay, ý nghĩa bạn hãy chia sẻ với bạn bè của mình và luôn theo dõi, ủng hộ chúng tôi để cập nhật những thông tin mới nhất. Chúc bạn một ngày tốt lành!