--- Bài mới hơn ---
Thỏa Thuận Trước Về Phương Pháp Xác Định Giá Tính Thuế Phương Pháp Tính Bằng Ngón Tay Giúp Bé Thông Minh Hơn Bé Học Toán Siêu Nhanh Với Toán Soroban Tính Nhẩm Bằng Ngón Tay Phương Pháp Tính Nhẩm Bằng Ngón Tay Bài Tập Phương Pháp Tính Giá
Các phương pháp để phân tích acid amin thường dựa trên việc tách các acid amin có trong mẫu thử bằng phương pháp sắc ký. Các thiết bị sắc ký tự động thường chiếm lợi thế. Thiết bị phân tích acid amin điển hình là một máy sắc ký lỏng áp suất thấp hoặc áp suất cao, có khả năng thực hiện chương trình dung môi để tách các acid amin khi qua cột sắc ký. Máy cần có thêm thiết bị tạo dẫn chất acid amin sau cột, trừ khi mẫu thử được tạo thành dẫn chất trước cột. Để phát hiện kết quả, thường dùng detector hấp thụ từ ngoại – khả kiến hoặc detector huỳnh quang, tùy thuộc vào cách tạo dần chất đã áp dụng. Một thiết bị tích phân cho phép chuyển đổi tín hiệu tương tự đi từ detector ra và cho phép định lượng.
Thường sử dụng các máy chuyên dụng để phân tích acid amin.
Nhiễu đường nền luôn là mối quan tâm của người tiến hành phân tích acid amin. Để khắc phục, phải dùng các thuốc thử có độ tinh khiết cao (ví dụ acid hydrocloric có độ tinh khiết thấp có thể gây nhiễm glycin). Thông thường cách một vài tuần lại phải thay mới các thuốc thử. Chỉ dùng các dung môi dùng cho sắc ký lỏng. Lọc lại các dung môi trước khi dùng để giảm thiểu sự nhiễm khuẩn và các tạp chất. Đậy kín các bình đựng dung môi. Không để các
thiết bị phân tích acid amin tiếp xúc trực tiếp với tia sáng mặt trời.
Chất lượng thực hành phòng thí nghiệm có thể quyết định chất lượng phân tích acid amin. Giữ phòng thí nghiệm sạch sẽ. Đặt thiết bị phân tích trong phòng thí nghiệm tại chỗ riêng biệt, ít bị ảnh hưởng của các hoạt động khác.
Định kỳ rửa sạch và chuẩn hóa lại các pipet. Bảo quản đầu pipet trong hộp đậy kín. Không được cầm đầu piped bằng tay trần, phải mang găng tay bằng cao su không xoa bột talc hoặc loại khác có chất lượng tương đương. Hạn chế số lần mở và đóng bình đựng mẫu thử vì bụi có thể làm gia tăng kết quả về hàm lượng các chất glycin, serin và alanin.
Cần bảo dưỡng tốt thiết bị phân tích acid amin để có kết quả chấp nhận được. Nếu thiết bị được dùng thường ngày thì hàng ngày phải kiểm tra độ rò rỉ dung môi của thiết bị, độ ổn định của đèn và detector, độ phân giải của cột. Định kỳ làm sạch hoặc thay thế các kính lọc của thiết bị và các linh phụ kiện cần bảo dưỡng khác
Các chất đối chiếu
Trên thị trường có sẵn các acid amin chuẩn để dùng trong phân tích acid amin; chúng thường là dung dịch hỗn hợp các acid amin chuẩn trong nước. Khi cần xác định thành phần acid amin trong một mẫu thử, các protein hoặc peptid chuẩn phải được phân tích song song với mẫu thử để kiểm tra sự toàn vẹn của thử nghiệm. Trong trường hợp này, chuẩn protein được sử dụng là albumin huyết thanh bò tinh khiết cao.
Chuẩn hóa thiết bị
Việc chuẩn hóa thiết bị phân tích acid amin được thực hiện bằng cách phân tích một chuẩn acid amin, gồm hỗn hợp các acid amin chuẩn đã biết trước hàm lượng của từng chất, để xác định hệ số đáp ứng và khoảng tuyến tính ứng với mỗi một acid amin chuẩn đã thử. Pha loãng mẫu chuẩn acid amin thành nhiều dung dịch có nồng độ khác nhau, nằm trong khoảng tuyến tính dự đoán trước của các acid amin có trong mẫu chuẩn. Tiến hành phân tích nhiều lần với mỗi nồng độ. Biểu thị kết quả thu được trên biểu đồ thể hiện tương quan giữa diện tích pic thu được ứng với mỗi nồng độ của acid amin đã thử. Nhờ biểu đồ này, có thể xác định được khoảng tuyến tính của mỗi acid amin, tại đó, các diện tích pic thu được có tương quan xấp xỉ tuyến tính với các nồng độ của các acid amin đã thử. Khi phân tích acid amin, để có kết quả đúng và lặp lại, điều quan trọng là phải pha và thử nghiệm trên các mẫu thử có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính tương ứng với kỹ thuật phân tích đang áp dụng.
Để xác định hệ số đáp ứng cho mỗi acid amin, ta phân tích hệ 4 nồng độ đến 6 nồng độ của acid amin chuẩn tương ứng. Hệ số đáp ứng tính được là giá trị trung bình của diện tích pic (hoặc của chiều cao pic) ứng với nồng độ 1 nanomol của dung dịch acid amin chuẩn. Thiết lập một dãy chuẩn hóa bao gồm hệ số đáp ứng tương ứng của các acid amin và sử dụng dãy này để tính nồng độ (nanomol) của mỗi acid amin có trong mẫu thử bằng cách chia diện tích pic (hoặc chiều cao pic) thu được của acid amin đó cho hệ số đáp ứng tương ứng có trong dãy chuẩn hóa.
Trong việc phân tích thường ngày, khi dùng dây chuẩn hóa, ta chỉ cần xác định một diện tích pic là đủ. Tuy nhiên, dây chuẩn hóa này phải thường xuyên được thử lại bằng các phân tích kiểm tra và được cập nhật để bảo đảm tính toàn vẹn của nó.
Muốn có các kết quả phân tích acid amin có chất lượng ổn định tại một phòng thí nghiệm phân tích, cần quan tâm đến độ lặp lại của phép định lượng, cần có một hệ thống thiết bị phân tích các acid amin có khả năng cung cấp các giá trị lặp lại của thời gian lưu của pic (để định tính) và các giá trị lặp lại của diện tích pic (để định lượng). Cách xác định tiêu biểu độ lặp lại bao gồm việc pha chế một dung dịch chuẩn các acid amin, rồi tiến hành đo mẫu đó nhiều lần (6 lần hoặc nhiều hơn). Sau đó, tính độ lệch chuẩn của các giá trị thời gian và độ lệch chuẩn các giá trị diện tích pic đã được tích phân, ứng với mỗi acid amin đã được phân tích. Việc xác định độ lặp lại còn được mở rộng bằng cách nhiều người phân tích khác nhau cùng tiến hành xác định độ lặp lại đó trong nhiều ngày. Người ta còn thực hiện vì ổn định lượng nhiều dung dịch có nồng độ khác nhau của chuẩn gốc đồ xác định sự biến thiên do việc pha chế mẫu thử. Thường người ta phân tích thành phần acid amin của một protein chuẩn (ví dụ albumin huyết thanh bò) để đánh giá độ lặp lại. Nhờ việc xác định độ lệch chuẩn. Ta có thể thiết lập các giới hạn phân tích để đạt kết quả tốt, với độ lệch chuẩn thấp nhất. Để giảm bớt sai số trong phân tích, nhiều yếu tố cần được quan tâm và xem xét đầy đủ như: cách chuẩn bị mẫu thử, nhiễu đường nền do chất lượng của các thuốc thử, việc thực hành thí nghiệm, tính năng và việc bảo dưỡng máy móc thiết bị, các dữ liệu phân tích và cách biện giải và cuối cùng là việc thực thi thành thạo của người làm phân tích.
Chuẩn bị mẫu thử
Muốn có kết quả phân tích acid amin đúng, phải dùng các mẫu thử protein và peptid đã tinh chế. Các tạp chất như các muối, ure, chất tẩy rửa… có thể gây nhiễu, nên cần phải loại khỏi mẫu thử trước khi tiến hành phân tích. Phương pháp điều chế dẫn chất sau cột sắc ký không bị nhiễm bởi các tạp chất ờ mức độ lớn như khi điều chế dẫn chất trước cột sắc ký. Nên giảm số thao tác trên mẫu thử để giảm nhiễu đường nền, tăng kết quả tìm thấy và giảm công lao động. Các cách thông thường để loại tạp chất trong mẫu thử protein bao gồm:
Tách bằng sắc ký lỏng cao áp pha đảo, thu protein bằng một dung môi bay hơi có chứa một lượng thích hợp thành phần hữu cơ rồi làm khô bằng ly tâm chân không;
Thấm tách loại bỏ tạp chất;
Ly tâm siêu lọc;
Kết tủa protein bằng một dung môi hữu cơ (ví dụ aceton);
Lọc qua gel.
Chất chuẩn nội
Cần dùng một chất chuẩn nội để kiểm soát những mất mát và biến đổi lý hóa học xảy ra trong quá trình phân tích acid amin. Do đó, trước khi tiến hành thủy phân phải thêm một lượng chính xác chất chuẩn nội vào dung dịch protein cần phân tích. Lượng chuẩn nội tìm thấy được số lá một thông số chung cho lượng tìm thấy được của các acid amin có trong protein. Tuy nhiên các acid amin tự do và các acid amin liên kết trong cấu trúc protein không giống nhau về tốc độ thủy phân hoặc phân hủy. Vì vậy việc dùng chất chuẩn nội để hiệu chỉnh sự mất mát trong quá trình thủy phân có thể cho kết quả không đáng tin cậy. Cần chú ý điều này khi biện giải kết quả phân tích. Ta còn có thể thêm chất chuẩn nội vào hỗn hợp các acid amin sau khi đã được thủy phân để hiệu chỉnh những sai lệch về kết quả phân tích gây ra do các sai lệch khi tiêm mẫu. Do thay đổi độ ổn định của thuốc thử cũng như tốc độ dòng của dung môi. Chất chuẩn nội lý tưởng là một acid amin bậc nhất nhân tạo. Có sẵn trên thị trường với giá rõ. Chất này phải bền vững trong quá trình thủy phân, có hệ số đáp ứng tuyến tính với nồng độ và phải được rửa giải cho một pic có thời gian lưu duy nhất và được phân giải tốt với các pic tương ứng với các acid amin khác. Các chất chuẩn nội thường được dùng bao gồm norleucin, nitrotyrosin và acid a-aminobutyric.
Thủy phân protein
Kỹ thuật thủy phân 1
Thủy phân bằng acidhydrocloric có chứa một lượng phenol là kỹ thuật thông dụng nhất để thủy phân mẫu thử protein/peptid trước khi tiến hành phân tích acid amin.
Thêm phenol vào môi trường thủy phân cốt để ngăn ngừa hiện tượng halogen hóa tyrosin.
Dung dịch thủy phân: Dung dịch acid hydrocloric 6 M chứa từ 0.1 % đến 1 % phenol.
Thủy phân pha lỏng: Cho vào ống thủy phân mẫu thử protein/peptid rồi làm khô (để loại nước, tránh pha loãng dung dịch thủy phân). Cứ 500 μg mẫu thử đông khô, ta thêm 200 μl dung dịch thủy phân. Làm lạnh ống thử trong aceton đông băng khan. Hàn ống thủy phân ở chân không. Thủy phân mẫu thử trong 24 h ở 110 °C và trong chân không hoặc khí trơ để tránh oxy hóa. Nếu lo ngại mẫu thử chưa được thủy phân hoàn toàn, cần nghiên cứu kéo dài thêm thời gian thủy phân (ví dụ trong 48 h và 72 h).
Thủy phân pha hơi: Đây là một trong các kỹ thuật thủy phân thông dụng nhất được ưa dùng để làm vi phân tích. khi chỉ có một lượng nhỏ mẫu thử. Kỹ thuật này cũng cho phép giảm thiểu việc mẫu thử bị nhiễm bẩn bởi dung dịch thủy phân. Đặt ống thủy phân chứa mẫu thử đã làm khô trong một ống thử to hơn, ống này chứa một lượng thích hợp dung dịch thủy phân và như vậy ngăn không cho mẫu thử tiếp xúc trực tiếp với dung dịch thủy phân. Hút chân không (áp suất thấp hơn 200 μm thủy ngân hoặc 20,7 Pa), hoặc bơm một khí trơ vào phần trên của ống thử. Hàn ống lớn và thủy phân ở 110 °C trong 24 h. Hơi acid sẽ thủy phân mẫu thử và lượng acid ngưng tụ trong ống thủy phân chứa mẫu thử là tối thiểu. Sau khi thủy phân xong, sấy khô mẫu thử trong chân không để loại bỏ acid dư thừa.
Kỹ thuật thủy phân 2
Giảm hiện tượng oxy hóa tryptophan trong khi thủy phân bằng cách dùng acid mercaptoethansulfonic (MESA) làm acid khử.
Dung dịch thủy phân: Dung dịch MESA 2,5 M.
Thủy phân pha hơi: Làm khô 1 μg đến 100 μg mẫu thử protein/peptid trong ống thủy phân. Đặt ống thủy phân trong một ống lớn hơn, chứa khoảng 200 μl dung dịch thủy phân. Hàn ống lớn trong chân không (áp suất khoảng 50 μm thủy ngân hoặc 6,7 Pa). Thủy phân ở 170 °C đến 185 °C trong khoảng 12.5 min. Sau khi thủy phân xong làm khô ống thủy phân ở chân không trong 15 min để loại acid dư thừa.
Kỹ thuật thủy phân 3
Ngăn ngừa hiện tượng oxy hóa tryptophan bằng cách dùng acid thioglycolic (TGA) làm acid khử.
Dung dịch thủy phân: Dung dịch acid hydrocloric 7 M chứa 1% phenol, 10 % acid trifluoroacetic và 20 % acid thioglycolic.
Thủy phân pha hơi: Làm khô từ 10 μg đến 50 μg mẫu thử protein/peptid trong một ống thủy phân. Đặt ống thủy phân trong một ống lớn hơn, chứa khoảng 200 μl dung dịch thủy phân. Hàn ống lớn trong chân không (áp suất khoảng 50 μm thủy ngân hoặc 6,7 Pa). Thủy phân mẫu thử ở 166°C trong khoảng 15 min đến 30 min. Sau khi thủy phân xong, làm khô ống thủy phân trong chân không trong 5 min để loại acid dư thừa.
Lượng tryptophan tìm thấy có thể phụ thuộc vào lượng mẫu lấy thử.
Kỹ thuật thủy phân 4
Oxy hóa cystein/cystin và methionin bằng acid performic trước khi thủy phân mẫu thử.
Dung dịch oxy hóa: Dùng acid performic mới pha bằng cách trộn đều 1 thể tích hydrogen peroxyd 30 % (TT) với 9 thể tích acid formic khan (TT), rồi để ở nhiệt độ phòng trong 1 h.
Tiến hành: Hòa tan mẫu thử protein/peptid trong 20 μl acid formic khan (TT) và để ở 50 °C trong 5 min. Sau đó thêm 100 μl dung dịch oxy hóa. Để phản ứng xảy ra trong 10 min đến 30 min. Cystein sẽ chuyển thành acid cysteic, còn methionin thành methionin sulfon. Ly tâm chân không để loại thuốc thử thừa, rồi thủy phân mẫu thử đã được oxy hóa theo kỹ thuật 1 hoặc 2 nói trên.
Kỹ thuật 4 này có thể làm biến đổi tyrosin khi môi trường có muối halid.
Kỹ thuật thủy phân 5
Oxy hóa cystein/cystin trong quá trình thủy phân pha lỏng bằng natri azid.
Dung dịch thủy phân: Thêm vào dung dịch acid hydrocloric 6 M (TT) có chứa 0,2 % phenol một lượng natri azid (TT) để có nồng độ 0,2 %. Phenol có trong dung dịch thủy phân ngăn ngừa sự halogen hóa của tyrosin.
Thủy phân pha lỏng: Thủy phân mẫu thử protein/peptid ở 110 °C trong 24 h. Trong quá trình thủy phân, cystein/ cyslin trong mẫu thử chuyển thành acid cysteic bởi tác dụng của natri azid có trong dung dịch thủy phân. Kỹ thuật 5 này cho kết quả tìm thấy của tyrosin tốt hơn kỹ thuật 4 nhưng lại không định lượng được methionin. Methionin chuyển thành hỗn hợp của methionin với 2 dẫn chất oxy hóa là methionin sulfoxid và methionin sulfon.
Kỹ thuật thủy phân 6
Oxy hóa cystein/cystin bằng dimethyl sulfoxid (DMSO) (TT).
Dung dịch thủy phân: Thêm vào dung dịch acid hydrocloric 6 M, chứa 0,1 °/o đến 1 % phenol, một lượng DMSO để được dung dịch nồng độ DMSO 2 % (tt/tt).
Thủy phân pha hơi: Tiến hành thủy phân mẫu thử protein/ peptid ở khoảng 110 °C trong 24 h. Trong quá trình thủy phân, cystein/cystin có trong mẫu thử sẽ bị DMSO có trong dung dịch thủy phân chuyển thành acid cysteic. Để hạn chế sự bất ổn định của kết quả thu được và để chỉnh lý những sai lệch do sự phân hủy từng phần, người ta khuyên nên xác định kết quả tìm thấy acid cysteic sau khi đã thủy phân oxy hóa các mẫu protein chuẩn chứa từ 1 mol đến 8 mol cystein. Các hệ số đáp ứng thu được từ các dung dịch thủy phân protein/peptid thường thấp hơn khoảng 30 % so với hệ số đáp ứng thu được từ các chuẩn acid cysteic không qua thủy phân.
Vì histidin, methionin, tyrosin và tryptophan đều bị biến đổi nên kỹ thuật 6 này không cho kết quả phân tích đầy đủ thành phần cấu tạo của protein/peptid.
Kỹ thuật thủy phân 7
Khử oxy và alkyl hóa cystein/cystin bằng phản ứng pyridylethyl hóa ở pha hơi.
Dung dịch khử: Cho vào một bình thích hợp: 83,3 μl pyridin (TT), 16,7 μl 4-vinylpyridin, 16.7 μl tributyl phosphin và 83,3 μl nước cất rồi trộn đều.
Tiến hành: Cho vào ống thủy phân một lượng mẫu thử protein/peptid (trong khoảng từ 1 μg đến 100 μg). Đặt ống thủy phân vào một ống lớn hơn đã có sẵn dung dịch khử.
Hàn kín ống lớn ở chân không (áp suất khoảng 50 μm thủy ngân hoặc 6,7 Pa) rồi làm nóng ở 100 °C trong 5 min. Sau đó lấy ống thủy phân ra, làm khô trong bình hút ẩm chân không trong 15 min để loại bỏ thuốc thử dư thừa. Cuối cùng thủy phân mẫu thử đã được pyridylethyl hóa, theo một trong các kỹ thuật thủy phân mô tả ở trên. Song song, tiến hành pyridylethyl hóa trong cùng điều kiện một mẫu chuẩn protein chứa 1 mol đến 8 mol cystein để xác định giá trị tìm thấy của pyridylethyl cystein.
Chú ý: Việc kéo dài thời gian phản ứng pyridylethyl hóa sẽ gây biến đổi các nhóm a-amino và f-amino của lysin có trong mẫu thử protein/peptid.
Kỹ thuật thủy phân 8
Khử oxy và alkyl hóa cystein/cystin bằng phản ứng pyridylethyl hóa ở pha lỏng.
Các dung dịch gốc: Pha chế và lọc 3 dung dịch trong nước sau đây:
Dung dịch cốc A: Dung dịch Tris-hydroclorid 1 M (pH 8,5) chứa 4 mM dinatri edetat.
Dung dịch gốc B: Dung dịch guanidin hydroclorid 8 M.
Dung dịch gốc C: Dung dịch 2-mercaptoethanol 10 %.
Dung dịch khử: Pha hỗn hợp gồm 1 thể tích dung dịch gốc A và 3 thể tích dung dịch gốc B để có dung dịch đệm guanidin hydroclorid 6 M trong Tris-hydroclorid 0,25 M.
Tiến hành: Hòa tan khoảng 10 μg mẫu thử protein/peptid trong 50 μl dung dịch khử, rồi thêm 2,5 μl dung dịch gốc C. Để 2 h ở nhiệt độ phòng, trong khí nitrogen hoặc argon và ở chỗ tối. Để thực hiện phản ứng pyridylethyl hóa, thêm vào khoảng 2 μl 4-vinylpyndin và để yên 2 h trong tối, ở nhiệt độ phòng. Sau đó, loại tạp bằng cách tách bằng sắc ký lỏng cao áp pha đảo. Làm khô mẫu thử protein/peptid sau khi qua sắc ký bằng cách ly tâm chân không rồi tiến hành thủy phân bằng acid.
Kỹ thuật thủy phân 9
Khử oxy và alkyl hóa cystein/cystin bằng phản ứng carboxymethyl hóa ở pha lỏng.
Các dung dịch gốc: Pha như ở kỹ thuật thủy phân 8.
Dung dịch carboxymethyl hóa: Dung dịch iodoacetamid 10 % trong ethanol 96 %.
Dung dịch đệm: Dùng dung dịch khử của kỹ thuật thủy phân 8.
Tiến hành: Hòa tan mẫu thử protein/peptid trong 50 μl dung dịch đệm, thêm khoảng 2,5 μl dung dịch gốc C. Bảo quản 2 h trong khí nitrogen hoặc argon ở nhiệt độ phòng và trong tối. Thêm một lượng dung dịch carboxymethyl hóa gấp 1,5 lần tổng lượng các thiol có trong mẫu thử theo lý thuyết. Nếu không biết hàm lượng các thiol trong mẫu thử thì cứ 20 nanornol protein dùng 5 μl dung dịch iodoacetamid 100 mM. Để tiếp 30 min trong tối ở nhiệt độ phòng. Sau đó thêm lượng dư 2-mercaptoethanol để dừng phân ứng. Loại tạp và thu phần protein/peptid bằng cách phân tách trên sắc ký lỏng pha đảo. Làm khô phần protein/ peptid thu được bằng ly tâm chân không trước khi thủy
phân bằng acid. Chất S-carboxyamidomethylcystein mới tạo thành được chuyển đổi thành S-carboxymethylcystein trong quá trình thủy phân.
Kỹ thuật thủy phân 10
Cystein/cystin tác dụng với acid dithiodiglycolie hoặc acid dithiodipropionic để cho một disulfid hỗn tạp. Tùy theo yêu cầu về độ phân giải của kỹ thuật phân tích acid amin được áp dụng mà chọn dùng acid dithiodiglycolic hoặc acid dithiodipropionic.
Dung dịch khử: Dung dịch acid dithiodiglycolic (hoặc acid dithiodipropionic) 1 % trong dung dịch NaOH 0,2 M.
Tiến hành: Cho vào ống thủy phân khoảng 20 μg mẫu thử protein/peptid. Thêm 5 μl dung dịch khử và 10 μl isopropanol. Ly tâm chân không để loại pha lỏng rồi thủy phân mẫu thử theo kỹ thuật thủy phân 1.
Kỹ thuật 10 này có lợi là các thành phần acid amin khác trong mẫu thử không bị ảnh hưởng của phản ứng và không cần loại tạp trước khi thủy phân.
Kỹ thuật thủy phân 11
Trong quá trình thủy phân bằng acid, asparagin và glutamin được chuyển đổi thành acid aspartic và acid glutamic tương ứng. Asparagin và acid aspartic được biểu thị bằng một đại
lượng chung Asx, còn glutamin và acid glutamic bằng Glx. Trái lại, khi thủy phân bằng acid với sự có mặt của thuốc thử bis ( 1,1-trifluoroacetoxy)iodbenzen (BTI), asparagin và glutamin bị tác dụng và chuyển tương ứng thành acid diaminopropionic và acid diaminobutyric. Nhờ đó, ta xác định được asparagin và glutamin trong protein/peptid ngay
khi có mặt của acid aspartic và acid glutamic.
Các dung dịch khử: Pha chế và lọc 3 dung dịch sau:
Dung dịch A: Dung dịch acid trifluormacetic 10 mM.
Dung dịch B: Dung dịch chứa guanidin hydroclorid 5 M và acid trifluoroacetic 10 mM.
Dung dịch C: Dung dịch mới pha BTI 3,6 % trong dimethylformamid.
Tiến hành: Cho vào một ống thủy phân sạch khoảng 200 μg mẫu thử protein/peptid, 2 ml dung dịch A hoặc dung dịch B và 2 ml dung dịch C. Hàn ống thủy phân trong chân không. Để 4h ở nhiệt độ 60 °C, trong tối. Sau đó tham tách mẫu thử bằng nước cất để loại bỏ thuốc thử dư thừa. Chiết mẫu thử đã thẩm tách 3 lần bằng 3 thể tích tương đương butyl acetat(TT), rồi làm đông khô. Cuối cùng thủy phân mẫu thử đông khô theo các kỹ thuật
thủy phân đã nói ở trên.
Các acid α,β-diaminopropionic và α,γ- diaminobutyric đều không được phân giải rõ ràng với lysin có trong mẫu thử, khi phân tách bằng sắc ký trao đổi ion. Vì vậy, khi dùng sắc ký trao đổi ion để tách các acid amin, hàm lượng của asparagin và của glutamin có mặt trong mẫu thử được xác định bằng hiệu số giữa hàm lượng của acid aspartic và của acid glutamic tương ứng thu được khi thủy phân acid không có BTI và hàm lượng của acid aspartic và của acid glutamic tương ứng thu được khi thủy phân có BTI.
Hàm lượng của threonin, methionin, cystein, tyrosin và histidin có thể bị sai lệch khi thủy phân bằng acid có BTI.
Vì vậy, muốn có giá trị đúng của các hàm lượng này, mẫu thử phải được thủy phân bằng acid, không có thuốc thử BTI.
Tách và phát hiện các acid amin
Tính kết quả
Khi xác định hàm lượng các acid amin trong một mẫu thử protein/peptid, cần nhớ rằng, trong quá trình thủy phân bằng acid, tryptophan và cystein bị phá hủy, serin và threonin bị phá hủy một phần, valin và isoleucin không được tách hoàn toàn, methionin có thể bị oxy hóa và một vài acid amin như glycin và serin thường bị nhiễu. Tiến hành phân tích ở môi trường chân không thích hợp (áp suất thấp hơn 200 μm thủy ngân hoặc 26,7 Pa) hoặc ở môi trường có khí trơ (như argon) khí thủy phân pha hơi, có thể giảm mức phân hủy do bị oxy hóa. Các kết quả định lượng cystein, tryptophan, threonin, isoleucin, valin, methionin, glycin và serin trong một mẫu thử protein/peptid đã thủy phân có thể thay đổi và do đó thường cần tiến hành xem xét đánh giá bổ sung.
Tính tỷ lệ phần trăm hàm lượng của một loại acid amin có trong mẫu thử protein/peptid
Đó là số lượng nanomol của một loại acid amin có trong 100 nanomol của toàn thể các acid amin có trong mẫu thử protein/peptid. Tỷ lệ này có ích trong việc đánh giá các dữ liệu thu được khi phân tích các acid amin trong một protein mà ta chưa biết khối lượng phân tử. Nó giúp củng cổ kết quả định tính một protein/peptid chưa biết bằng cách so sánh tỷ lệ phần trăm hàm lượng mỗi loại acid amin trong mẫu thử chưa biết với tỷ lệ phần trăm hàm lượng của mỗi loại acid amin tương ứng có trong các protein/peptid đã biết.
Tính tỷ lệ phần trăm hàm lượng của một acid amin trong protein/peptid theo công thức sau
100 ri / rl
Trong đỏ:
là đáp ứng (hàm lượng) tính theo nanomol của acid amin i;
là đáp ứng (hàm lượng) tính theo nanomol của tất cả các acid amin thu được trên sắc đồ.
Mẫu thử protein/peptid chưa biết
Xác định khối lượng Q, (tính theo microgam) của mọi loại acid amin có mặt trong mẫu protein/peptid chưa biết Tính bằng công thức sau:
Trong đó:
Q i là khối lượng (tính theo microgam) của acid amin i có trong mẫu thử;
m i là hàm lượng (tính theo nanomol) của tất cả các acid amin i tìm thấy trên sắc đồ;
M i là phân tử lượng trung bình (tính theo gam) của acid amin i, đã được hiệu chỉnh về khối lượng H 20 bị loại khi tạo thành liên kết peptid.
Ước lượng tổng khối lượng của mẫu thử protein/peptid:
Tổng khối lượng ∑Qi của các loại acid amin tìm thấy cho phép ta ước lượng khối lượng của protein/peptid đem thử sau khi đã hiệu chỉnh về khối lượng mất mát do có sự phân hủy từng phần hoặc toàn phần của một số acid amin dễ bị phân hủy trong quá trình thủy phân.
Xác định số lượng của mỗi loại acid amin tham gia cấu tạo mẫu thử protein/peptid chưa biết. Nếu xác định được phân tử lượng M p của protein/peptid đem thử (ví dụ bằng khối phổ), ta tính số lượng của mỗi loại acid amin i theo công thức sau:
mi / ( 1000 Qp / Mp) = ( mi x Mp )/ 1000 Qp
Trong đó:
là hàm lượng (tính theo nanomol) của acid amin i tìm thấy trong mẫu thử;
là khối lượng (tính theo microgam) của protein đem thử;
là phân tử lượng của protein đem thử (tính theo gam).
Mẫu thử protein/peptid đã biết phân tử lượng và thành phần cấu tạo
Khi phân tích acid amin, một số acid amin cho kết quả tìm thấy tốt, trái lại, một số cho kết quả tìm thấy không sử dụng được vì hoặc bị phân hủy một phần hay toàn phần (ví dụ: tryptophan, cystein, threonin, serin, methionin), hoặc liên kết peptid không được tách hoàn toàn (như liên kết của isoleucin, của valin), hoặc bị nhiễu bởi một số acid amin tự do (như bởi glycin và serin). Các acid amin cho kết quả tìm thấy tốt điển hình là aspartat-asparagin, glutamatglutamin, alanin, leucin, phenylalanin, lysin và arginin.
Danh sách này có thể thay đổi tùy thuộc vào hệ thống phân tích đã dùng. Các acid amin cho kết quả tìm thấy tốt đại diện cho protein, do đó ta lợi dụng chúng để xác định hàm lượng protein và số lượng của mỗi loại acid amin (còn gọi là thành phần của acid amin) có trong mẫu thử.
Xác định hàm lượng protein trong mẫu thử
Chia hàm lượng (tính theo nanomol) của mỗi loại acid amin có giá trị tìm thấy tốt cho số lượng dự đoán của acid amin đó trong protein để có hàm lượng protein tính theo loại acid amin đó. Tính giá trị trung bình của tất cả các hàm lượng protein tính được theo từng loại acid amin có giá trị tìm thấy tốt của mẫu thử. Các hàm lượng protein tính theo từng loại acid amin riêng rẽ phải được phân bố đồng đều xung quanh giá trị trung bình của hàm lượng protein mới tính được ở trên. Phải loại bỏ các giá trị hàm lượng protein riêng rẽ của từng acid amin quả sai lệch với giá trị trung bình đã tính được. Thường các giá trị sai lệch quá 5 % phải loại bỏ. Khi đó, phải tính lại giá trị trung bình của hàm lượng protein mới, dựa trên các giá trị còn lại (không bị loại bỏ) của hàm lượng protein riêng rẽ tính theo từng loại acid amin còn lại.
Xác định số lượng của từng loại acid amin trong mẫu thử
Chia hàm lượng của mỗi loại acid amin cho giá trị trung bình của hàm lượng protein đã tính ở trên, ta được số lượng của loại acid amin đó (tức thành phần acid amin) trong mẫu thử.
Tính sai số tương đối (theo tỷ lệ phần trăm) về thành phần trong mẫu thử Áp dụng công thức sau để tính sai số tương đối về thành phần đối với một loại acid amin i:
100 mi / mis
Trong đó:
m i là hàm lượng, tính theo nanomol, xác định bằng thực nghiệm, của loại acid amin i có trong mẫu thử;
m is là hàm lượng (tính theo nanomol) đã biết của loại acid amin i có trong mẫu thử.
Giá trị sai số tương đối trung bình về thành phần của mẫu thử là giá trị trung bình của tất cả các sai số tương đối về thành phần tính theo từng loại acid amin riêng rẽ, trừ tryptophan và cystein. Giá trị sai số tương đối trung bình về thành phần của một mẫu thử cung cấp thông tin quan trọng về độ ổn định của phép phân tích theo thời gian. Sự phù hợp giữa giá trị thành phần acid amin trong mẫu thử, tìm thấy bằng thực nghiệm với giá trị thành phần acid amin đã biết trước của protein đem thử có thể giúp cho việc củng cố kết quả định tính và xác định độ tinh khiết của protein trong mẫu thử.
--- Bài cũ hơn ---
Các Phương Pháp Phân Tách Và Nhận Diện Các Axit Amin Và Peptit Từ Các Hợp Chất Tự Nhiên (Phần 2) Phương Pháp Phân Tích Định Tính Và Định Lượng Protein Lương Cơ Bản Tiếng Anh Là Gì? Cách Tính Lương Cơ Bản 2022 Top 7 Cách Tính Nhẩm Nhanh Phép Nhân Hiệu Quả Nhất 7 Phương Pháp Dạy Trẻ Tính Nhẩm Nhanh Và Phát Triển Tư Duy