--- Bài mới hơn ---
Nghiên Cứu Chiết Tách Polyphenol Từ Cây Điều Để Làm Chất Kháng Oxi Hóa Ứng Dụng Của Phenol / Chloroform Trong Tách Chiết Dna, Rna Kỹ Thuật Vi Chiết Pha Rắn Spe Solid Phase Extraction Hãng Supelco Đại Cương Chiết Pha Rắn Và Ứng Dụng Của Chiết Pha Rắn Các Phương Pháp Tách Chiết Axit Nucleic
Phương pháp chiết pha rắn
Chiết pha rắn là một dạng sắc ký lỏng được cải tiến thành hấp thụ pha rắn với các cơ chế khác nhau. Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc sự phân bố của chất tan giữa hai pha không tan vào nhau đã sử dụng phương pháp chiết pha rắn để xử lý mẫu nhằm xác định đồng thời các chất amphetamin, methamphetamin, 3,4-methylenedioxyamphetamin, 3,4-m ethylene-dioxymethamphetamin, N-methyl-1-(3,4-methyl-enedioxyphenyl)-2-butanamin, 3,4-methylenedioxyethylamphetamin, p-methoxymethamphetamin, ephedrin, N-methylephedrin, cathinon, methcathinon và ketamintrong nước tiểu. Cột Oasis MCX (1 mL, 30 mg; Waters, USA) được hoạt hóa bằng 1 mL MeOH, 1ml nước đề-ion. 4 mL mẫu nước tiểu (được axit hóa bằng 200 µL HCl 5 M, thêm 0,25 ng/mL dung dịch chất nội chuẩn MA-d 5) được rung siêu âm 5 phút ở tốc độ 8000 rpm sau đó được cho chảy qua cột MCX. Cột chiết được rửa với 1ml HCl 0,1M; 1 mL MeOH; 1 mL dung dịch amoniac 5%.Chất phân tích được rửa giải bằng 1 mL 5% amoniac trong MeOH. Hiệu suất thu hồi của các chất đều nằm trong khoảng 70,3 ÷ 107,9 %.
Các tác giả Đặng Đức Khanh, Trần Việt Hùng, Trần Thị Thúy đã sử dụng cột chiết trao đổi ion (benzensulphonyl silica, 1mL) để xử lí mẫu nước tiểu. Quy trình như sau: Cột chiết được hoạt hóa bằng metanol (2 mL), nước cất (1 mL) và axit photphoric 10 mM (0,5 mL) dưới áp suất giảm. Lắc 1 mL nước tiểu với 0,5 mL axit photphoric 10 mM trong 1 ống nghiệm sau đó đưa vào cột chiết đã hoạt hóa. Sau khi đuổi hết không khí (khoảng 30 giây), rửa lần lượt bằng 1 mL axit photphoric 10 mM, 0,5 mL axit axetic 0,1 M và 1 mL metanol. Loại bỏ không khí trong cột, sau đó tiến hành rửa giải bằng 2 mL dung dịch amoniac 3%/metanol (v/v), làm khô dưới áp suất giảm dòng nitơ, thu cặn chiết và tiến hành phân tích.
Như vậy, có thể nhận thấy có nhiều phương pháp xác định các chất ma túy nhưng các phương pháp này đều đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, yêu cầu kỹ thuật cao. Tuy nhiên, phương pháp điện di mao quản cho thấy rất có tiềm năng bởi vì phương pháp điện di mao quản sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc (CE-C 4 D) là phương pháp phân tích mới với những ưu điểm như: thiết bị tương đối đơn giản, chi phí thấp, hoạt động đơn giản, có thể tự động hóa và triển khai phân tích ngay tại hiện trường với một lượng nhỏ mẫu và hóa chất phục vụ kịp thời quá trình điều tra. Do đó, chúng tôi tập trung nghiên cứu quy trình phân tích một số chất ma túy tổng hợp ATS trên thiết bị điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc, kết nối kiểu tụ điện.
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
2.1. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu của luận văn là: Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu nước tiểu để phân tích một số chất ma túy tổng hợp nhóm ATS (gồm: MA, MDA, MDMA, MDEA) bằng phương pháp điện di mao quản, sử dụng detector đo độ dẫn không tiếp xúc theo kiểu kết nối tụ điện (CE-C 4 D).
2.1.2. Nội dung nghiên cứu
Để đạt được mục tiêu đề ra, các nội dung nghiên cứu cần thực hiện bao gồm:
– Tổng quan tài liệu về các phương pháp khác nhau để xác định đồng một số hợp chất ma túy tổng hợp nhóm ATS và các phương pháp xử lý mẫu nước tiểu.
– Xây dựng đường chuẩn của các chất phân tích.
- Đánh giá phương pháp phân tích (xác định LOD, LOQ, độ đúng, độ chụm).
- Nghiên cứu, tối ưu quy trình chiết lỏng và chiết pha rắn để xử lý làm sạch, làm giàu mẫu nước tiểu.
- Áp dụng phân tích một số mẫu nước tiểu do Viện Khoa học hình sự và Đội giám định hóa học – Phòng kỹ thuật hình sự – CATP Hà Nội cung cấp.
- Thực hiện phân tích đối chứng một số mẫu bằng phương pháp GC/MS do Viện Khoa học hình sự thực hiện.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân tích
Phương pháp phân tích là phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (CE – C 4D). Thiết bị này được thiết kế và chế tạo bởi Công ty 3Sanalysis ( http://www.3sanalysis.vn/) trên cơ sở hợp tác với nhóm nghiên cứu của GS. Peter Hauser (Thụy Sỹ), là thiết bị có nguồn thế cao lên đến 20kv, có thể thực hiện bán tự động (hình 2.1). Hệ thiết bị này hiện đang được triển khai nghiên cứu hoàn thiện và phát triển ứng dụng tại Bộ môn Hóa Phân tích, Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội và khảo sát các điều kiện thiết bị, hóa chất, chúng tôi thực hiện quy trình chiết xuất như sau:
– Xử lý mẫu nước tiểu bằng phương pháp chiết pha rắn: sử dụng cột C18 dung tích 3ml.
1. Hoạt hóa cột ( 3ml MeOH, 3ml H 2 O, 3ml đệm phốt phát pH 6)
2. Nạp mẫu ( 5 ml nước tiểu, 0,5ml đệm phốt phát pH 6)
3. Rửa tạp chất ( 1ml H 2O, 2ml H 3PO 4 10mM, 2ml MeOH/H 2 O 1/9 v/v)
4. Rửa giải ( 2ml MeOH ngâm 5 phút), thu dịch chiết
5. Cô cạn dịch chiết bằng dòng khí nito, sau đó hòa tan vào MeOH và pha loãng với tỉ lệ thích hợp rồi tiến hành phân tích trên thiết bị CE.
– Xử lý mẫu nước tiểu bằng phương pháp chiết lỏng:(chiết lặp 2 lần)
1. Lấy mỗi mẫu 5 ml nước tiểu vào ống nghiệm có nắp xoáy
2. Kiềm hóa mẫu về pH 9 bằng dung dịch NH3 (kiểm tra bằng giấy quỳ) 3. Chiết mẫu bằng 3 ml etyl axetat, lắc trong vòng 10 phút.
4. Ly tâm cho tách lớp (tốc độ 8000 vòng/phút trong 20 phút)
5. Hút lớp etyl axetat (lớp trên) đến khi hết dịch trong thì cho 200µl MeOH vào lắc nhẹ giúp làm giảm huyền phù trong mẫu rồi tiếp tục hút thu tiếp dịch chiết.
6. Cô cạn dịch chiết bằng dòng khí nito, sau đó hòa tan vào MeOH và pha loãng với tỉ lệ thích hợp rồi tiến hành phân tích trên thiết bị CE.
2.3. Hóa chất và thiết bị
2.3.1. Hóa chất
Tất cả các hóa chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích và được pha chế bằng nước deion.
2.3.1.1. Chất chuẩn
- MA (Lipomed, hàm lượng dạng bazơ =80,2%)
- MDA (Lipomed, hàm lượng dạng bazơ = 82,8%)
- MDMA (Lipomed, hàm lượng dạng bazơ = 83,71%)
- MDEA (Lipomed, hàm lượng dạng bazơ = 84,66%)
2.3.1.2. Hóa chất, dung môi
- Axit acetic (CH3COOH), (PA, Merck, Đức)
- Axit clohydric (HCl), (PA, Merck, Đức)
- Axit photphoric (H3PO4) (PA, Deajung, Hàn Quốc, 85%)
- Natri hydroxyd (NaOH), (PA, Merck, Đức)
- Methanol (CH3OH), (PA, Merck, Đức)
- Diclometan (CH2Cl2), (PA, Deajung, Hàn Quốc, 99%)
2.3.1.3. Chuẩn bị các dung dịch hóa chất
* Pha các dung dịch chuẩn gốc
Cân chính xác từng chất phân tích trên cân phân tích (độ chính xác 0,1mg): 0,0125 g MA, 0,0121 g MDA, 0,0119 g MDMA, 0,0118 g MDEA chuyển vào bình định mức 10,0 mL, thêm 4 mL Methanol và đem rung siêu âm 30 phút sau đó định mức đến vạch bằng nước deion ta được các dung dịch chuẩn gốc 1000ppm.
Các dung dịch chuẩn nồng độ nhỏ hơn được pha loãng bằng nước deion theo tỉ lệ thích hợp từ dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm trước khi phân tích.
* Pha dung dịch đệm điện di
Dung dịch pha động điện di kết hợp giữa Arginine và axit acetic được pha như sau: Cân chính xác 0,0435g Arginine chuyển vào cốc có mỏ 50,0 mL rung siêu âm trong 5 phút cho tan hết sau đó thêm từ từ axit axetic vào đến khi pH của dung dịch là 4.5 (sử dụng máy đo pH). Dung dịch đệm được pha mới hàng ngày.
2.3.2. Thiết bị, dụng cụ
*Thiết bị
– Thiết bị điện di mao quản CE-C 4 D như đã trình bày ở mục 2.2.1.
– Thiết bị lọc nước deion (Mỹ).
– Máy rung siêu âm, có gia nhiệt của hãng BRANSONIC 521.
– Máy đo pH của hãng HANNA với điện cực thủy tinh và các dung dịch pH chuẩn để hiệu chỉnh điểm chuẩn của máy đo pH.
– Cân phân tích của hãng S¢ientech (Mỹ), độ chính xác 0,1mg.
– Tủ lạnh Sanaky VH-2899W dùng bảo quản mẫu
Dụng cụ:
– Dụng cụ thủy tinh: bình định mức, pipet, cốc, ống nghiệm.
– Pipet paster các loại: 10; 20; 100; 200; 5000 µL.
– Các lọ Falcon 15ml để đựng dung dịch chuẩn.
– Một số dụng cụ thông thường khác trong phòng thí nghiệm.
2.4. Các phương pháp đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích
2.4.1. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của thiết bị
Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền .
– Độ lặp lại của phương pháp được xác định qua độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) theo các công thức sau:
RSD (%) còn được gọi là hệ số biến thiên (CV%). Người ta thường sử dụng độ lệch chuẩn tương đối (RSD) hơn là độ lệch chuẩn (SD) do có thể đánh giá được độ lệch chuẩn chiếm bao nhiêu phần trăm giá trị trung bình và có cái nhìn rõ hơn về độ chụm của các số liệu trong tập số liệu lặp lại.
Trong đó:
– S i là diện tích của pic điện di thứ i
– S tb là diện tích trung bình của n lần phân tích
– n là số lần phân tích lặp lại
2.4.3. Độ đúng (độ thu hồi) của thiết bị, của phương pháp
Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của dãy lớn các kết quả thí nghiệm và các giá trị quy chiếu được chấp nhận. Do đó, thước đo độ đúng thường đánh giá qua sai số tương đối hay bằng phương pháp xác định độ thu hồi và bước đầu đã đạt được một số kết quả về điều kiện tối ưu phân tích 4 chất ma túy MA, MDA, MDMA và MDEA. Tuy nhiên, do nền mẫu nước tiểu phức tạp và hàm lượng các chất phân tích trong nước tiểu thường rất nhỏ nên việc xử lý mẫu là rất cần thiết. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tập trung vào quy trình xử lý mẫu nước tiểu trên cơ sở kỹ thuật chiết lỏng – lỏng và chiết pha rắn nhằm nâng cao hiệu quả phân tích bốn chất ma túy nhóm ATS nêu trên bằng phương pháp CE-C 4D. Các nội dung nghiên cứu cụ thể bao gồm: xây dựng và đánh giá lại đường chuẩn, giá trị LOD, LOQ tại thời điểm nghiên cứu; khảo sát điều kiện tối ưu xử lý mẫu nước tiểu trên cơ sở kỹ thuật lỏng -lỏng và chiết pha rắn (SPE) nhằm nâng cao hiệu quả phân tích; áp dụng phân tích một số mẫu thực tế và tiến hành đối chứng với phương pháp truyền thống (GC-MS) do Viện Khoa học Hình sự thực hiện.
3.1. Xây dựng đường chuẩn của các chất phân tích
3.1.1. Xây dựng đường chuẩn
Các dung dịch sử dụng để lập đường chuẩn có nồng độ trong khoảng 5÷120 với MA và 10÷140ppm với MDA, MDAM, MDEA và được pha loãng từ các dung dịch chuẩn gốc ban đầu. Mỗi dung dịch được bơm 3 lần và thực hiện quá trình điện di trên thiết bị điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc với các điều kiện tối ưu như sau:
- Mao quản silica đường kính trong ID = 50 µm, tổng chiều dài: 60cm (chiều dài hiệu dụng 53cm).
- Phương pháp bơm mẫu: Thủy động lực học kiểu xiphông ở độ cao 10 cm.
- Thời gian bơm mẫu: 45 s
- Dung dịch đệm điện di: Arg/Ace (10 mM) pH = 4,5.
- Thế tách: 10 kV
- Giá trị diện tích pic trung bình là kết quả được sử dụng để lập đường chuẩn.
Các kết quả đo được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ
MA, MDA, MDMA, MDEA
Hình 3.1. Đường chuẩn của MA Hình 3.2. Đường chuẩn của MDA
Hình 3.3. Đường chuẩn của MDMA Hình 3.4. Đường chuẩn của MDEA
Tra bảng chuẩn t với bậc tự do f = 5, độ tin cậy 95% có t = 2,57, kết hợp với các giá trị a, b, S a, S b, S y của các chất từ phần mềm origin 6.1 ta có phương trình hồi quy của các chất phân tích:
Bảng 3.2. Phương trình hồi quy của các chất phân tích
Chất phân tích
Phương trình hồi quy
Hệ số tương quan R 2
Từ các kết quả trên cho thấy hệ số tương quan R 2 của các chất phân tích đều lớn hơn 0,99 đồng thời giá trị P value<0,05 chứng tỏ x và y có quan hệ tuyến tính.
3.1.2. Đánh giá phương trình hồi quy của đường chuẩn
Trong phương trình hồi quy y = a + bx, trường hợp lý tưởng xảy ra khi không có chất phân tích thì không có tín hiệu. Tuy nhiên, trong thực tế các số liệu phân tích thường mắc sai số ngẫu nhiên luôn làm cho a ≠ 0.Nếu giá trị a khác 0 có ý nghĩa thống kê thì phương pháp phân tích mắc sai số hệ thống.Vì vậy, trước khi sử dụng đường chuẩn cho chất phân tích công cụ thì cần kiểm tra sự khác nhau giữa giá trị a và 0 có ý nghĩa thống kê không.
* Kiểm tra a với giá trị 0:
Nếu xem a ≈ 0 thì phương trình y = a + bx được viết thành y = b’x. Thay các giá trị x i, y i vào phương trình y = b’x ta sẽ được các giá trị b ‘i và tính
;
Phương sai của hai phương trình được tính như sau:
--- Bài cũ hơn ---
Các Phương Pháp Chiết Xuất Curcumin Từ Nghệ Phương Pháp Ngâm Trong Kỹ Thuật Bào Chế Hướng Dẫn Cách Chiết Nước Hoa Sang Lọ Nhỏ Đơn Giản Tại Nhà Bật Mí Cách Để Các Lọ Nước Hoa Chiết Ra Đời Cách Chiết Nước Hoa Ra Chai Nhỏ Đơn Giản